葵力果胶囊

目前，化疗和光动力疗法已经成为肿瘤治疗中的重要手段，两者的联合疗法更是有助提升肿瘤的治疗效果。韩国忠南大学Jae-Young Lee教授团队开发出低氧缓解血红蛋白(Hb)纳米簇用于宫颈癌的化疗-光动力PDT联合治疗。Hb与Ce6和生物素化聚乙二醇键合，表面吸附阿霉素(DOX)，形成直径为220 nm的蛋白纳米簇NC。这些携带氧气的NC，即DOX@HPBC，与天然Hb和pH响应性药物释放相比，在血清中表现出更好的胶体稳定性，有利于癌症治疗。DOX@HPBC在缺氧培养的HeLa细胞中可以有效减轻64.8%的缺氧，并使相关生物标志物HIF-1α和MDR1水平正常化。此外，HeLa单层和球形培养的抗肿瘤疗效试验表明，DOX@HPBC的治疗效果比DOX和Ce6物理混合物提高了3.8倍，显示出化疗和PDT的协同作用。这些结果表明，DOX@HPBC具有改善缺氧的作用，降低肿瘤组织中HIF-1α和MDR1水平，并有效地向肿瘤缺氧区域递送DOX，DOX@HPBC可能是一种有前景的化疗- PDT联合治疗宫颈癌的新策略。相关工作以“Hypoxia-alleviating hemoglobin nanoclusters for sensitizing chemo-photodynamic therapy of cervical cancer”为题于2022年12月29日发表在“Chemical Engineering Journal”上。

图1 DOX@HPBC制备及其化学-PDT联合疗法机制的示意图。

为了更好地利用Hb缓解乏氧的作用，作者假设Hb分子本身需要作为光敏剂，在时间和空间上共定位PDT和氧气供应。Ce6通过酰胺键对Hb进行化学修饰，得到HC。在Ce6偶联的样品中，Ce6的吸收峰移至665 nm，这意味着Ce6与Hb之间形成了化学键。然后，HC通过β-珠蛋白单位(即Cys-93)的巯基用mPEG-MAL或生物素- PEG-MAL修饰，分别得到HPC或HPBC。通过电泳凝胶样品的PEG和蛋白染色证实了Hb衍生物的聚乙二醇化。考马斯蓝染色显示，在20-25 kDa和35-48 kDa的PEGylated样品条带上出现了新的蛋白条带。从β-珠蛋白(~16 kDa)和PEG试剂(~5 kDa)的分子量来看，20 ~ 25 kDa和35 ~ 48 kDa的条带可能分别来自β-PEG单体和α/β-PEG二聚体。带子上的钡也呈阳性碘化染色，表明PEG分子的存在。这一结果得到MALDI-TOF质谱分析的支持，其中β-PEG单体峰仅在PEG化的Hb衍生物中观察到。质荷比约为22000，表明每个β-珠蛋白单位与PEG分子以1:1的M比缀合。Ce6和PEG的偶联改变了Hb分子的ζ电位。所有Ce6修饰的Hb衍生物都比相应的对照组带更多的负电荷，这可能是由于Ce6分子的自由羧酸基。此外，PEG修饰的分子相比未修饰的分子表现出更低的zeta电位，这可能归因于PEG分子的屏蔽作用。使用SOSG试剂评估Hb衍生物的单线态氧(1O2)生产效。660 nm激光照射下HPC和HPBC产生的1O2明显高于HC。这一结果表明HC的聚乙二醇化可以缓解胶体不稳定性引起的自猝灭。尽管1 μg/ mL的游离Ce6在10分钟内表现出最高的1O2生产效率，但不仅在20分钟内观察到饱和，而且在没有适当的增溶剂的情况下，Ce6本身也会在体内给药所需的更高浓度下析出。所有Hb衍生物在250秒内将DO水平提高到高于2 mg/L，显示出与未改性Hb相当的氧释放特征。总之，光敏性Hb衍生物被成功制备，而不影响天然Hb的携氧能力，DOX是一种疏水模型药物，通过疏水相互作用吸附到Hb衍生物上，这是一种新的蛋白质结合方法，不仅是一种有效的载药机制，而且还诱导蛋白质分子自组装，在水环境中形成稳定的NCs。含有DOX的Hb NC，包括DOX@Hb、DOX@HC、DOX@HPC和DOX@HPBC，平均水动力直径为230 nm，适合静脉给药。然而，TEM分析显示，只有PEG修饰的DOX@HPC和DOX@HPBC呈现出均匀的球形形态，这意味着蛋白骨架的PEG修饰对于稳定的NC形成至关重要。在不同pH条件下评估PEG修饰的Hb NCs的DOX释放模式，DOX@HPC和DOX@HPBC以持续和pH依赖的方式释放DOX长达120小时。与pH 7.4相比，pH 5.5和6.8更易释放DOX，这可能是由于DOX在酸性pH下溶解度增加，从而减少了药物与Hb NCs之间的疏水相互作用。pH值5.5、6.8、7.4分别代表内溶酶体、肿瘤微环境、血腔(或正常组织)，酸性条件下较高的药物释放量可能会增加肿瘤组织中DOX的暴露。

图2 Ce6和生物素化PEG偶联Hb衍生物(A-E)的表征。

作者通过近红外荧光成像(NIRF)评估聚乙二醇化Hb NCs的生物分布，其中用Cy5.5用于标记HPC和HPBC，制备好的NCs静脉注射给Hela异种移植小鼠。全身扫描显示，两种NCs在24小时内均优先在肿瘤和肾中积累。离体成像证实了这一趋势，肿瘤和肾脏表现出明显高于其他器官的辐射效率值。肝脏和肺的含量极少，这表明聚乙二醇化的Hb颗粒在血液循环过程中可以分解成单个蛋白质分子。作者在HeLa肿瘤异种移植小鼠模型中评估了DOX@HPBC诱导的化疗-PDT的治疗效果和安全性。DOX@HPC和DOX@HPBC几乎完全抑制了肿瘤生长，与未治疗组相比，第15天肿瘤体积分别缩小了97.3%和96.6%。虽然DOX(单药治疗)和DOX + Ce6(物理混合)也能有效抑制肿瘤生长，在相同剂量下，与未治疗组相比，体重在第15天严重下降(分别下降了28.3%和26.3%)。此外，DOX-或DOX + Ce6-治疗组白细胞计数下降0.53-或0.40倍，而DOX@HPC和DOX@HPBC治疗组无显著降低。作者在组织水平上评估了所开发的NC的减轻乏氧效果及其DOX递送效率。将DOX + Ce6(物理混合物)、DOX@HPC或DOX@HPBC (DOX和Ce6均为5mg /kg)经静脉注射给荷瘤小鼠，每隔一天激光照射一次，随后给予吡莫硝唑进行缺氧示踪。对解剖肿瘤进行的缺氧染色显示，与不干预和DOX + Ce6治疗相比，DOX@HPC和DOX@HPBC改善了肿瘤的缺氧，这与体外HG试验一致。此外，在两组制剂中，包括吡莫尼唑染色区域在内的整个肿瘤组织中都观察到DOX荧光，而在DOX + Ce6组中检测到的信号有限。这些结果支持了DOX@HPC和DOX@HPBC可以缓解肿瘤缺氧，并在体内有效地将DOX输送到肿瘤缺氧区域的观点。在上述化疗- PDT方案后，使用抗体微阵列分析肿瘤组织中凋亡相关蛋白的相对表达模式。与未处理相比，DOX@HPBC处理导致大多数促凋亡蛋白的表达上调，包括p27(1.72±0.03)、FasL(1.67±0.09)、DR6(1.55±0.02)、BID(1.55±0.05)和TNF-α(1.53±0.02)，而抗凋亡蛋白的表达呈混合模式。DOX + Ce6和DOX@HPC处理也表现出类似的模式，但变化大多小于DOX@HPBC处理。这些结果可以解释为，与其他药物相比，DOX@HPBC增强了DOX的积累，以及DOX随后发挥的促凋亡作用。

图3 利用NIRF成像评估DOX@HPBC在HELA -肿瘤异种移植小鼠模型中的生物分布

总而言之，作者开发了一种新型基于化疗- PDT联合治疗的药物，可有效缓解宫颈癌的肿瘤乏氧。生物素化PEG被引入到Ce6修饰的Hb中以提高稳定性和靶向性，与未PEG化的相比，这提高了ROS的生成效率。通过将DOX加载到PEG化的Hb衍生物上，导致蛋白质分子的自组装，产生稳定的NC。DOX@HPBC NCs通过生物素受体相互作用表现出更好的细胞摄取和球体穿透。体外验证的增强抗癌作用和改善缺氧的潜力成功转化为体内治疗效果的改善，宫颈肿瘤显著抑制，以及乏氧标志物水平的改善。这些结果表明DOX@HPBC是一种很有前途的宫颈癌化疗- PDT联合治疗策略。

文章来源：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.141224

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